一、洋蔥伯克霍爾德菌簡(jiǎn)介

  洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cepacia）（1950年Burkholder首-次自洋蔥根部分離）因引起洋蔥腐爛而得名，原歸類假單胞菌屬，定名為洋蔥假單胞菌。1992年，Yabuuchi等正式將該菌與類鼻疽伯克霍爾德菌、唐菖蒲伯克霍爾德菌、皮氏伯克霍爾德菌和鼻疽伯克霍爾德菌等歸為一個(gè)新屬，即伯克霍爾德菌屬。該菌在醫(yī)院環(huán)境中廣泛存在，尤其在囊性纖維化（cystic fibrosis，CF）和慢性肉芽腫?。╟hronic granulomatous disease，CGD）患者痰液中易分離到。目前國(guó)內(nèi)外研究資料提示該菌臨床分離率不斷增加，且對(duì)現(xiàn)有的抗菌藥物具有較高的耐藥性。

  洋蔥伯克霍爾德菌是一種帶尾絲革蘭陰性桿菌，在血平板上菌落呈淡黃色，濕潤(rùn)、凸起、渾濁，不溶血；麥康凱平板上為乳糖不發(fā)酵菌落，細(xì)小而清晰，延長(zhǎng)培養(yǎng)48h后中心呈粉紅色。

二、參考標(biāo)準(zhǔn)

  《SN/T 4684-2016 進(jìn)出口化妝品中洋蔥伯克霍爾德菌檢驗(yàn)方法》

三、檢驗(yàn)程序

  洋蔥伯克霍爾德菌檢驗(yàn)程序見圖1。

圖1 洋蔥伯克霍爾德菌檢驗(yàn)程序

四、操作步驟和結(jié)果判斷

4.1 增菌培養(yǎng)

  按照GB 7918.1方法制備1:10化妝品稀釋液，取稀釋液10mL加到90mL含多粘菌素B的SCDLP增菌液中，于36℃±1℃培養(yǎng)24h，移取1mL，轉(zhuǎn)種于10mL含慶大霉素的BCSA增菌液內(nèi)，于36℃±1℃培養(yǎng)18 h~24 h。

  含多粘菌素B的SCDLP增菌液原理：酪蛋白胨和大豆蛋白胨提供微生物生長(zhǎng)所需的氮源、維生素和生長(zhǎng)因子；氯化鈉維持均衡的滲透壓；磷酸氫二鉀為培養(yǎng)基pH的緩沖劑；葡萄糖為可發(fā)酵的糖類；卵磷脂和吐溫80能中和防腐劑，并能起到在乳濁液中分散物質(zhì)的功能，卵磷脂能中和季銨鹽，吐溫80可中和酚、六氯酚、福爾馬林，兩者結(jié)合可中和乙醇；多粘菌素B可抑制銅綠假單胞菌和其他伯克霍爾德菌生長(zhǎng)。

  用法：稱取本品31.0g，另取吐溫80 7.0g加熱溶解于1000mL蒸餾水中，分裝，121℃高壓滅菌20分鐘，冷卻，使用前，按每100mL培養(yǎng)基中加入過(guò)濾除菌的多粘菌素B 25000U，混勻，備用。

  洋蔥伯克霍爾德菌在含多粘菌素B的SCDLP增菌液中生長(zhǎng)良好，結(jié)果如圖2所示：

圖2 在含多粘菌素B的SCDLP增菌液中的生長(zhǎng)情況

  含慶大霉素的BCSA增菌液原理：酪蛋白胨、酵母提取物提供細(xì)菌生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)；氯化鈉維持滲透壓；慶大霉素為廣譜抗生素，對(duì)多數(shù)假單胞菌屬、變形桿菌屬、大腸菌群、葡萄球菌屬、需氧芽孢桿菌屬等多種革蘭氏陰陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抗菌活性，結(jié)晶紫主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和念珠菌的生長(zhǎng)；乳糖和蔗糖為可發(fā)酵碳源；酚紅為酸堿指示劑，洋蔥伯克霍爾德氏菌可氧化發(fā)酵蔗糖產(chǎn)少量酸，不發(fā)酵乳糖，生長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)基微變黃色。

  用法：稱取本品36.58g，加熱煮沸，完-全溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶或試管，115℃高壓滅菌15分鐘，使用前，按每100mL培養(yǎng)基中加入過(guò)濾除菌的慶大霉素1mg，混勻，備用。

  洋蔥伯克霍爾德菌在含慶大霉素的BCSA增菌液中生長(zhǎng)良好，結(jié)果如圖3所示：

圖3 在含慶大霉素的BCSA增菌液中的生長(zhǎng)情況

4.2 分離培養(yǎng)

  分別用接種環(huán)取BCSA增菌液一環(huán)，劃線接種于BCSA瓊脂（含多粘菌素B、慶大霉素）平板和麥康凱瓊脂（含多粘菌素B、慶大霉素）平板，于32℃±1℃培養(yǎng)48 h，觀察各個(gè)平板上生長(zhǎng)的菌落。

  含多粘菌素B、慶大霉素的BCSA瓊脂原理：酪蛋白胨、酵母提取物提供細(xì)菌生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)；氯化鈉維持滲透壓；慶大霉素為廣譜抗生素，對(duì)多數(shù)假單胞菌屬、變形桿菌屬、大腸菌群、葡萄球菌屬、需氧芽孢桿菌屬等多種革蘭氏陰陽(yáng)性菌有較強(qiáng)的抗菌活性；結(jié)晶紫主要抑制革蘭氏陽(yáng)性菌和念珠菌的生長(zhǎng)；乳糖和蔗糖為可發(fā)酵碳源；酚紅為酸堿指示劑，洋蔥伯克霍爾德氏菌可氧化發(fā)酵蔗糖產(chǎn)少量酸，不發(fā)酵乳糖，生長(zhǎng)時(shí)培養(yǎng)基微變黃色。

  USP42標(biāo)準(zhǔn)中洋蔥伯克霍爾德氏菌特征為生長(zhǎng)帶有黃色光環(huán)的綠棕色菌落，或被粉紅色區(qū)域包圍的白色菌落。

  用法：稱取本品50.58g，加熱煮沸，完-全溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，115℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至50℃左右時(shí)，按每100mL培養(yǎng)基中加入過(guò)濾除菌的多粘菌素B 60000U和慶大霉素1mg，混勻，傾入無(wú)菌平皿，備用。

  洋蔥伯克霍爾德菌在含多粘菌素B、慶大霉素的BCSA瓊脂平板上的菌落為菌落呈淡黃色至淡紅色，表面光滑，周圍培養(yǎng)基變紅，結(jié)果如圖4所示：

洋蔥伯克霍爾德菌ATCC 25416

圖4 BCSA瓊脂（含多粘菌素B、慶大霉素）平板上的菌落特征

  含多粘菌素B、慶大霉素的麥康凱瓊脂原理：蛋白胨提供細(xì)菌生長(zhǎng)的基本營(yíng)養(yǎng)；氯化鈉維持滲透壓；多粘菌素B主要抑制多數(shù)革蘭氏陰性細(xì)菌的生長(zhǎng)，慶大霉素為廣譜抗生素，對(duì)多種革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌均有抑制作用；牛膽鹽主要可抑制革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)；乳糖為可發(fā)酵碳源；中性紅為酸堿指示劑，洋蔥伯克霍爾德氏菌不發(fā)酵乳糖，菌落通常呈黃褐色或微紅色，周圍培養(yǎng)基通常不變色或因產(chǎn)堿變?yōu)槌赛S色，而發(fā)酵乳糖的雜菌在培養(yǎng)基上則呈現(xiàn)桃紅色，菌落周圍可有沉淀環(huán)，與洋蔥伯克霍爾德氏菌區(qū)分開來(lái)。

  用法：稱取本品54.03g，加熱煮沸，完-全溶解于1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，115℃高壓滅菌20分鐘，冷卻至50℃左右時(shí)，按每100mL培養(yǎng)基中加入過(guò)濾除菌的多粘菌素B 25000U和慶大霉素1mg，混勻，傾入無(wú)菌平皿，備用。

  洋蔥伯克霍爾德菌在含多粘菌素B、慶大霉素的麥康凱瓊脂平板上的典型菌落為淺黃褐色圓形菌落，表面光滑，周圍培養(yǎng)基通常不變色或因產(chǎn)堿變?yōu)槌赛S色，結(jié)果如圖5所示：

洋蔥伯克霍爾德菌ATCC 25416

圖5 麥康凱瓊脂（含多粘菌素B、慶大霉素）平板上的菌落特征

4.3 鑒定

4.3.1 初篩

  自選擇性瓊脂平板上分別挑取5個(gè)以上典型或可疑菌落，同一菌株接種于2支葡萄糖氧化/發(fā)酵管，其中一支加滅菌液體石蠟封口，另一支不封口，于36℃±1℃培養(yǎng)24h，二者均變黃為葡萄糖發(fā)酵型，未加石蠟管變黃而加石蠟管不變色為葡萄糖氧化型。同時(shí)在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線純化，于36℃±1℃培養(yǎng)24 h，選擇葡萄糖氧化型（加石蠟管不變黃，不加石蠟管變黃）的純培養(yǎng)物繼續(xù)進(jìn)行鑒定；洋蔥伯克霍爾德菌的葡萄糖生化管結(jié)果如圖6所示。

圖6 葡萄糖氧化/發(fā)酵管試驗(yàn)結(jié)果

4.3.2 革蘭氏染色

  挑取可疑菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色。顯微鏡下觀察，洋蔥伯克霍爾德菌為革蘭氏陰性桿菌，如圖7所示。

圖7 革蘭氏染色鏡檢結(jié)果

4.3.3 氧化酶試驗(yàn)

  用玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)特征性菌落，涂布在氧化酶試劑濕潤(rùn)的濾紙平板上。洋蔥伯克霍爾德菌為遲緩型氧化酶陽(yáng)性（紫紅色、紫色或深藍(lán)色），反應(yīng)時(shí)間約為2min~10min，如圖8所示。

  注：實(shí)驗(yàn)中切勿使用鎳/鉻材料。

圖8 氧化酶試驗(yàn)結(jié)果

4.3.4 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)

  用玻璃棒或一次性接種針挑取單個(gè)特征性菌落，置于潔凈載玻片上，滴加3%過(guò)氧化氫溶液，觀察氣泡產(chǎn)生情況。洋蔥伯克霍爾德菌為遲緩產(chǎn)氣，1s后緩慢出現(xiàn)氣泡，如圖9所示。

圖9 過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)結(jié)果

4.3.5 蔗糖氧化

  挑取可疑菌落接種于蔗糖氧化培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)基變黃色為陽(yáng)性。洋蔥伯克霍爾德菌為陽(yáng)性反應(yīng)，如圖10所示。

圖10 蔗糖氧化試驗(yàn)結(jié)果

4.3.6 枸櫞酸鹽利用

  挑取可疑菌落接種于西蒙氏枸櫞酸鹽培養(yǎng)基，36℃±1℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)基變藍(lán)色為陽(yáng)性，綠色為陰性。洋蔥伯克霍爾德菌為陽(yáng)性反應(yīng)，如圖11所示。

圖11 西蒙氏枸櫞酸鹽利用結(jié)果

4.3.7 七葉苷利用

  挑取可疑菌落接種于七葉苷培養(yǎng)基，30℃±1℃培養(yǎng)24h，培養(yǎng)基變黑色為陽(yáng)性，不變色為陰性。洋蔥伯克霍爾德菌為陽(yáng)性反應(yīng)，如圖12所示。

圖12 七葉苷利用結(jié)果

4.3.8 替代試驗(yàn)

  可選擇生化鑒定試劑盒或全自動(dòng)微生物生化鑒定系統(tǒng)，根據(jù)4.3.1的初步判斷結(jié)果，對(duì)可疑菌落進(jìn)行鑒定。

4.4 結(jié)果報(bào)告

  綜合以上試驗(yàn)結(jié)果，報(bào)告10g（mL）樣品中檢出或未檢出洋蔥伯克霍爾德菌。

五、附錄：

  《GB/T 7918.1-1987 化妝品微生物標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 總則》樣品處理方法

注:本文屬海博生物原創(chuàng),未經(jīng)允許不得轉(zhuǎn)載。