一、 引言

  前期曾介紹了乳酸菌的分類和乳酸菌檢驗(yàn)所用的幾種主要培養(yǎng)基，本文將進(jìn)一步就GB 4789.35中乳酸菌檢驗(yàn)時(shí)所用的計(jì)數(shù)方法和規(guī)則進(jìn)行詳細(xì)解讀。

二、計(jì)數(shù)方法

  《GB 4789.35 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》中，主要涉及了3種乳酸菌，分別為乳桿菌屬、雙歧桿菌屬和嗜熱鏈球菌屬。由于3種乳酸菌的培養(yǎng)條件和特征各有不同，要檢驗(yàn)出樣品中乳酸菌的總數(shù)，就需要根據(jù)菌種的不同選擇使用合適的培養(yǎng)基，對(duì)結(jié)果進(jìn)行計(jì)數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)中是這樣規(guī)定的:（表1）

  其中：

  6.2.3.2 是使用改良MRS培養(yǎng)基傾注，厭氧培養(yǎng)，對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)；

  6.2.3.3 是使用MC培養(yǎng)基傾注，需氧培養(yǎng)，對(duì)嗜熱鏈球菌進(jìn)行計(jì)數(shù)；

  6.2.3.4 是使用MRS培養(yǎng)基傾注，厭氧培養(yǎng)，對(duì)乳桿菌（或乳桿菌與雙歧桿菌）進(jìn)行計(jì)數(shù)。

  從表中可以看出，在檢驗(yàn)乳酸菌數(shù)量時(shí)，是分了3種情況分別進(jìn)行規(guī)定：

1、單一菌種的情況

  （1）只有雙歧桿菌時(shí)，使用MRS培養(yǎng)基或者雙歧桿菌瓊脂傾注、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)；

  （2）只有乳桿菌時(shí)，使用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)；

  （3）只有嗜熱鏈球菌時(shí)，使用MC培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)。此處需要說(shuō)明一下，嗜熱鏈球菌在MRS上也能生長(zhǎng)良好（如圖1），所以當(dāng)只有這種單一菌種存在時(shí)，日常工作中，如果不需要完-全按照國(guó)標(biāo)要求，是否可以使用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)計(jì)數(shù)？

圖1 MRS上三種菌的生長(zhǎng)情況

  綜合比較，當(dāng)只有單一菌種存在的情況下，如果不需要嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)要求來(lái)操作，只需要將樣品稀釋后，取合適濃度用MRS培養(yǎng)基進(jìn)行傾注計(jì)數(shù)即可。MRS可以作為通用培養(yǎng)基使用。

2、兩種菌的情況

  如果樣品中有兩種菌存在，除了要檢驗(yàn)出乳酸菌的總數(shù)外，有時(shí)還需要對(duì)其中各個(gè)菌種的數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

  （1）含有雙歧桿菌和乳桿菌時(shí)，使用MRS培養(yǎng)基對(duì)樣品進(jìn)行傾注后厭氧培養(yǎng)，即可得出兩種乳酸菌的總數(shù)；而如果還想知道里面所含雙歧桿菌的數(shù)目，則需要同時(shí)用改良MRS進(jìn)行傾注計(jì)數(shù)，改良MRS上長(zhǎng)出的菌落數(shù)，即為雙歧桿菌的數(shù)目。

  （2）含有雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)中使用改良MRS和MC進(jìn)行傾注計(jì)數(shù)，分別得出雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的數(shù)目，兩者加在一起即為菌落總數(shù)。采用改良MRS對(duì)雙歧桿菌進(jìn)行計(jì)數(shù)，這個(gè)沒(méi)有爭(zhēng)議，因?yàn)樵诟牧糓RS瓊脂中，只有雙歧桿菌能生長(zhǎng)，嗜熱鏈球菌不能生長(zhǎng)。

  在MC瓊脂上，雖然在厭氧條件下，嗜熱鏈球菌和雙歧桿菌都能生長(zhǎng)（如圖2），但本標(biāo)準(zhǔn)中要求需氧培養(yǎng)，所以此時(shí)MC瓊脂上長(zhǎng)出的就只有嗜熱鏈球菌了。這個(gè)方法是可以達(dá)到計(jì)數(shù)嗜熱鏈球菌的目的的。

圖2 厭氧培養(yǎng)條件下MC瓊脂上雙歧桿菌和嗜熱鏈球菌的生長(zhǎng)狀態(tài)

  在日常工作中，如果不嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)要求，我們也可以選擇使用MRS瓊脂和改良MRS瓊脂進(jìn)行傾注培養(yǎng)，MRS平板上所有菌落之和即為菌落總數(shù)，改良MRS平板上的菌數(shù)即為雙歧桿菌的菌數(shù)。

  （3）含有乳桿菌和嗜熱鏈球菌時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)中采用MRS瓊脂厭氧培養(yǎng)和MC瓊脂需氧培養(yǎng)進(jìn)行計(jì)數(shù)，分別得出乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數(shù)目，兩者之和算作乳酸菌的總數(shù)。

  這一規(guī)定的問(wèn)題在于：因?yàn)檫@兩種菌都能在這兩種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好，即MRS瓊脂上可以長(zhǎng)出乳桿菌和嗜熱鏈球菌（嗜熱鏈球菌在MRS培養(yǎng)基上厭氧培養(yǎng)的結(jié)果，如圖3），MC瓊脂上也能長(zhǎng)出乳桿菌和嗜熱鏈球菌，只是菌落大小的差異。其中在MRS瓊脂上，雖然多數(shù)乳桿菌菌落較大，但對(duì)于有些乳桿菌（如德氏乳桿菌CICC 6032），菌落直徑也很小，跟嗜熱鏈球菌很容易混淆（如圖3）。

圖3  MRS上德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌的菌落形態(tài)

  同樣，兩種菌在MC瓊脂上的菌落形態(tài)如下圖（圖4）：

圖4 德氏乳桿菌和嗜熱鏈球菌在MC培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

  所以，要想從同一種培養(yǎng)基上，明顯地區(qū)分出兩種菌來(lái)，分別計(jì)數(shù)，確實(shí)也不容易。

  問(wèn)題的關(guān)鍵在于，標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定，將兩種培養(yǎng)基上培養(yǎng)出的菌數(shù)，進(jìn)行相加，即得乳酸菌總數(shù)。通過(guò)上面的分析，我們不難得出，這樣處理，得出的結(jié)果實(shí)際上是把乳酸菌總數(shù)翻倍了，即乳桿菌和嗜熱鏈球菌的數(shù)目分別重復(fù)了兩遍，并且也不能明確得出每種乳酸菌的具體數(shù)目。

  綜合以上三種情況，我們可以總結(jié)為，在不需要嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)操作的前提下，如果已知樣品中有兩種乳酸菌，要檢驗(yàn)樣品中的乳酸菌總數(shù)，只要用MRS進(jìn)行傾注就可以了，平板上長(zhǎng)出的菌數(shù)即為乳酸菌總數(shù)；而要確切地知道其中某一種菌的數(shù)目，則要根據(jù)情況進(jìn)行培養(yǎng)基的選擇：使用改良MRS可以很容易得出雙歧桿菌的數(shù)目，使用MC可以勉強(qiáng)計(jì)出嗜熱鏈球菌的數(shù)目，但要注意避免其他菌種的干擾；對(duì)于乳桿菌的數(shù)目，只要用菌落總數(shù)減去已經(jīng)計(jì)出的另一種菌的數(shù)目即可。

3、三種菌的情況

  標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定，用MC需氧培養(yǎng)，得出嗜熱鏈球菌的數(shù)目；MRS厭氧培養(yǎng)，得出乳酸菌和雙歧桿菌的總數(shù)，將兩者加和，即為乳酸菌總數(shù)；如果要單獨(dú)檢驗(yàn)雙歧桿菌的數(shù)目，則采用改良MRS瓊脂進(jìn)行厭氧培養(yǎng)后計(jì)數(shù)可得。

  這里同樣存在上面所述的問(wèn)題。

  對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)中為什么這么寫，我們可以理解成，它默認(rèn)了在MRS瓊脂上嗜熱鏈球菌不會(huì)生長(zhǎng)，而在MC瓊脂上乳桿菌不會(huì)生長(zhǎng)？但這明顯是與我們實(shí)際操作情況不相符的。

  如果按照這種要求進(jìn)行計(jì)數(shù)，終所得的數(shù)目，將會(huì)把乳桿菌和嗜熱鏈球菌重復(fù)計(jì)數(shù)。

  在日常工作中，如果不需要嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)操作，要解決這一問(wèn)題，我們還是借助這兩種培養(yǎng)基，只要將MRS上長(zhǎng)出的所有菌落數(shù)出來(lái)，即為樣品中的菌落總數(shù)。而如果非要追究里面所含嗜熱鏈球菌的數(shù)目，只能借助MC瓊脂，計(jì)數(shù)時(shí)要仔細(xì)甄別，不要誤將乳桿菌計(jì)成了嗜熱鏈球菌，從而導(dǎo)致結(jié)果誤差；用菌落總數(shù)減去嗜熱鏈球菌的數(shù)目，即為乳桿菌的數(shù)目。

  這樣一來(lái)，我們可以將上面三種情況進(jìn)行總結(jié)，如下表：

表2  乳酸菌計(jì)數(shù)時(shí)培養(yǎng)基的選擇及計(jì)數(shù)方法表

注：表格中所有使用MC瓊脂的，均采用需氧培養(yǎng)方式；其它培養(yǎng)基均為厭氧培養(yǎng)

  通過(guò)表格，我們可以一目了然地對(duì)乳酸菌計(jì)數(shù)中使用的培養(yǎng)基進(jìn)行選擇：在不需嚴(yán)格按照國(guó)標(biāo)要求進(jìn)行操作的情況下，不管樣品中含有幾種菌，只要求總數(shù)，統(tǒng)一用MRS瓊脂即可，MRS瓊脂可以算得上檢驗(yàn)乳酸菌菌落總數(shù)的“培養(yǎng)基"；在多種菌種共存的情況下，要想知道雙歧桿菌的數(shù)目，直接選擇改良MRS；對(duì)于嗜熱鏈球菌可以通過(guò)計(jì)算或MC傾注的方式得到，本人建議能計(jì)算的情況下，計(jì)算方法；而對(duì)于乳桿菌的數(shù)目，只能采用計(jì)算的方法得到，因?yàn)镚B中并沒(méi)有一種特定的培養(yǎng)基，能將乳桿菌與其它種類的乳酸菌區(qū)分開(kāi)來(lái)。

三、計(jì)數(shù)規(guī)則

  上面討論的三種乳酸菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)方法，當(dāng)選用了合適的方法，培養(yǎng)出菌落后，怎么選擇合適的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，也是實(shí)驗(yàn)人員要面臨的問(wèn)題。

  對(duì)于這一點(diǎn)，標(biāo)準(zhǔn)中逐條做出了規(guī)定，為了方便大家理解和掌握，筆者特整合成下面的圖示進(jìn)行說(shuō)明（圖5），希望能給廣大實(shí)驗(yàn)人員提供幫助。

圖5 菌落計(jì)數(shù)規(guī)則

四、說(shuō)明

  在樣品（包括食品、藥品、化妝品等）檢驗(yàn)過(guò)程中，檢驗(yàn)人員應(yīng)首先參考相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行各項(xiàng)操作，只要標(biāo)準(zhǔn)沒(méi)有錯(cuò)誤，就應(yīng)該嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的條件和方法來(lái)檢驗(yàn)，這樣才能保證檢驗(yàn)結(jié)果的一致性和可靠性。但是，如果標(biāo)準(zhǔn)中的個(gè)別地方出現(xiàn)了明顯的疑義或者有些方法不利于正確結(jié)果的判斷，究竟該怎么處理，要具體情況具體分析。

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